介质的选择
在HIC中，应选机械强度较大的刚性基质；若待分离物质分子量很大，且样品量较大，则应选大孔基质，如琼脂糖凝胶；若待分离物质较小，或样品量很小，但分辨率的要求高，则可选孔径小的基质甚至非孔型基质。
HIC介质中，烷基配基的链长大多在C4～C8之间，苯基的疏水性大致与戊基相当，因与溶质发生π-π相互作用，它与戊基有不同的选择性，而寡聚乙二醇固定相的疏水性介于丁基与苯基之间 。
样品的准备
往样品中添加足够浓度的盐，使样品溶液中的盐浓度达到与流动相A（平衡液）中基本一致，并调节样品溶液的pH使其满足吸附条件 ，同时选择适当浓度及pH的缓冲液。
HIC的样品体积受样品中组分浓度和介质的结合容量的影响，对于稀释样品无需浓缩可以直接加样。
层析条件的优化
优化目标：
目标分子达所需纯度的基础上，获得尽可能高的回收率，同时力求缩短分离所需时间、降低分离成本。
HIC中，层析条件包括流动相A，流动相B，洗脱方式，层析柱的柱长，流速，温度等 。
流动相A的缓冲液的种类、pH ，盐的种类和浓度的选择：
缓冲液种类据所需的pH选择，注意目标物的稳定性，浓度一般在0.01--0.05mol/L；
不同盐类对疏水作用的强度有影响，层析中的选择性也不尽相同；盐浓度也随目标分子的疏水性而异，(NH4)2SO4常用0.75～2mol/L，NaCl为1～4mol/L；
流动相B为含盐量较低的缓冲液，缓冲液类型与流动相A一致。
洗脱的方式：
采用降低流动相中盐浓度的方式洗脱（最常用）；
通过往流动相中添加有机溶剂 ，如：乙二醇、丙醇、异丙醇等，降低流动相极性的方式洗脱 （溶剂中稳定性良好的物质）；
往流动相中添加去污剂等 ，去污剂本身能与介质发生强烈吸附，从而将结合在其上的目标组分置换下来（分离膜蛋白）。
洗脱理论：
疏溶剂理论：1976年由Sinanoglu等人提出，认为由于溶质分子有减少其与水接触的非极性表面的倾向，而增加了与疏水配基结合的概率。
自由能分离理论：1979年Vanoss等人提出，认为生物体界面自由能比水低，与配基产生范德华力，这个引力随溶液盐析能力的改变而改变。
熵分离理论：1984年Regnier提出，认为高盐溶液中，蛋白质疏水区域的邻近分子是有序排列，疏水部分易于配基结合，减弱了水分子排列的有序度，表面水分子被排斥开，使体系熵增加。
层析介质的再生、贮存
再生：常规用蒸馏水清洗，如有疏水性很强的物质如脂类、变性蛋白等牢固结合在介质上，则需合适的清洗剂进行清洗，NaOH溶液是其中常用的一种清洗剂，它在清洗层析柱的同时还能使微生物钝化灭活起到消毒的效果。此外，促溶盐类的水溶液也是良好的清洗剂。
贮存：一般悬浮在20%的乙醇中，如在水溶液体系中保存，则需添加一定量的防腐剂，以防止微生物的生长
